作者：天堂硅谷投資管理部
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一、前言：血漿蛋白構(gòu)成
人體血液共分為血漿（50%）、紅細(xì)胞（42%）、白細(xì)胞和血小板（8%），其中血漿由水（90%）、糖類電解質(zhì)（3%）和蛋白質(zhì)（7%）組成。血液中不同的蛋白組分經(jīng)分離提純后可制成血液制品，針對不同病癥的患者使用。血液制品是從7%的蛋白質(zhì)中分離提純制成的。
圖表 1 - 血漿、血漿和血漿蛋白類別構(gòu)成
血漿中的有效成本數(shù)量超過200種，可分離純化超過100種，經(jīng)常研究的約70種，國內(nèi)臨床的產(chǎn)品約20種。
圖表2 - 海外血漿蛋白開發(fā)情況
（弘則研究）
二、分離提純工藝介紹
分離提純是血制品的制備過程中的核心環(huán)節(jié)之一，利用不同血液組分之間性質(zhì)差異，使用物理或化學(xué)手段將其彼此分離，形成可供治療使用的產(chǎn)品。目前，血制品企業(yè)常用的生產(chǎn)工藝通常分為低溫乙醇法和層析法兩大類。
低溫乙醇法（國元證券）
二戰(zhàn)時(shí)期美國教授Cohn首創(chuàng)血漿蛋白純化分離技術(shù)，被業(yè)界成為Cohn法。該方法通過對原料血漿的蛋白質(zhì)濃度、pH值、乙醇濃度、離子強(qiáng)度、溫度這5大參數(shù)的調(diào)整，逐級沉淀血漿，將血漿分為五個沉淀組分，血漿蛋白也按分子大小順序先后分離至各組分中。二十世紀(jì)六十年代，瑞士的Nitschmann和Kistler教授對Cohn法進(jìn)行改進(jìn)，成功縮短了生產(chǎn)的周期同時(shí)提高了收率，形成Nitschmann-Kistler法。
層析法
層析法（Chromatography，又稱色譜法）利用不同物質(zhì)在不同相態(tài)的選擇性分配，以“流動相”對“固定相”中的混合物進(jìn)行洗脫，混合物中不同的物質(zhì)會以不同的速度沿“固定相”移動，最終達(dá)到分離的效果。
層析法的構(gòu)成十分豐富。根據(jù)層析床的形狀，可分為柱層析（Column chromatography）和平面層析（Planar chromatography）；根據(jù)流動相的物理性狀，可以分為氣體層析（Gas Chromatography）、液體層析（Liquid chromatography）；根據(jù)分離機(jī)制，可以分為離子交換層析（Ion exchange chromatography）、擴(kuò)張床層析（Expanded bed adsorption chromatographic separation）。
生產(chǎn)血制品時(shí)常見的層析手段如下：
（Wikipedia、《層析技術(shù)在血液制品分離純化中應(yīng)用的探討》、財(cái)通證券）
親和層析：將具有特殊結(jié)構(gòu)的親和分子制成固相吸附劑放置在層析柱中，當(dāng)要被分離的蛋白混合液通過層析柱時(shí)，與吸附劑具有親和能力的蛋白質(zhì)就會被吸附而滯留在層析柱中，沒有親和力的蛋白質(zhì)由于不被吸附，直接流出，從而與被分離的蛋白質(zhì)分開；該方法將乙醇冷沉淀組分或經(jīng)DEAE 處理后組分流經(jīng)偶聯(lián)有肝素、賴氨酸、明膠等特異性配基的層析柱，使其特異性吸附后，再調(diào)整鹽濃度及pH 值將其洗脫，適用于獲取免疫球蛋白、抗凝血酶及a1-抗胰蛋白酶、a2-巨球蛋白等；
離子交換層析：以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離；該方法將乙醇冷沉組分或血漿經(jīng)除鹽處理后組分以適宜的pH、離子強(qiáng)度、流速流經(jīng)DEAE、Q、CM 等層析柱，使其吸附或使雜蛋白吸附，從而達(dá)到分離目的；適用于獲取大多數(shù)血液制品組分及去除內(nèi)毒素；
擴(kuò)張床層析：將冷凍血漿于常溫融化后，按特定流速自下而上流經(jīng)層析柱，其中雜質(zhì)及細(xì)小碎片直接流穿，隨后調(diào)節(jié)流速、pH、鹽濃度，依次洗脫各組分；適用于凝血酶原復(fù)合物、凝血因子VIII、VWF、免疫球蛋白、α1-抗胰蛋白酶、白蛋白；
凝膠過濾層析：又稱為分子篩層析或體積排阻層析，是利用有一定孔徑范圍的多孔凝膠作為固定相，對混合物中各組分按分子大小進(jìn)行分離的層析技術(shù)；以較低流速用于分離第一步或最后一步: 前者主要使用G25，用于除鹽處理; 后者使用S200或S300，用于蛋白細(xì)分或去病毒處理；主要用于獲得抗凝血酶、白蛋白等以及去除HAV病毒。
離心/壓濾工藝（國元證券）
在生產(chǎn)血液制品的過程中，通常在中間環(huán)節(jié)中采用離心或者壓濾工藝進(jìn)一步分離沉淀和上清，以加速沉淀的形成。其中，
離心工藝：利用離心機(jī)旋轉(zhuǎn)運(yùn)動的離心力以及物質(zhì)的沉降系數(shù)或浮力密度的差異進(jìn)行分離、濃縮和提純
壓濾工藝：依靠重力和外界施加的壓力，促使懸浮液向特定的方向流動，同時(shí)懸浮液內(nèi)的雜質(zhì)受到過濾介質(zhì)的支撐力而被截留，從而分離濾液與雜質(zhì)，離心工藝具有更高的白蛋白回收率。
三、工藝應(yīng)用情況
《層析技術(shù)在血液制品分離純化中應(yīng)用的探討》
鑒于血制品產(chǎn)業(yè)對安全可靠性的要求較高，生產(chǎn)工藝的發(fā)展相對穩(wěn)健，新生產(chǎn)工藝的研發(fā)和投入使用周期很長。企業(yè)會根據(jù)實(shí)際需求、監(jiān)管要求、生產(chǎn)穩(wěn)定性、投入產(chǎn)出比等諸多因素綜合選擇生產(chǎn)工藝或多種生產(chǎn)工藝之間的組合。鑒于不同生產(chǎn)工藝的適用范圍、安全性、可靠性、生產(chǎn)效率存在一定差異。同一種血液制品可以用多種工藝或工藝組合生產(chǎn)。
白蛋白
人血白蛋白生產(chǎn)可以僅a)單純采用低溫乙醇工藝，也可以b)將低溫乙醇工藝搭配層析工藝搭配使用，此外也有海外廠商開發(fā)出了無需使用低溫乙醇法的c)全層析以及擴(kuò)張床工藝。低溫乙醇工藝將組分V沉淀經(jīng)過純化、脫醇、濃縮等環(huán)節(jié)即可得到人血白蛋白。本文摘錄的博雅生物招股書中所列示生產(chǎn)工藝即是單純使用低溫乙醇法生產(chǎn)人血白蛋白的流程。
單純采用低溫乙醇法生產(chǎn)的人血白蛋白產(chǎn)品純度在90%左右；引入層析供以后，白蛋白純度可以進(jìn)一步提升。以CSL研發(fā)的生產(chǎn)流程為例，該流程首先使用低溫乙醇法分離出組分II+III上清液（不再生產(chǎn)組分V沉淀），經(jīng)過超濾、除鹽、脫乙醇后，使用離子交換層析和凝膠柱層析工藝，可以生產(chǎn)純度達(dá)到99.5%的白蛋白。
上述生產(chǎn)流程仍然涉及使用低溫乙醇法作為前道工序；而最新的全層析工藝和擴(kuò)張床工藝，都已可以直接從血漿分離出最終組分，并具有極高的純度。同時(shí)，因?yàn)槲词褂脷溲趸X吸附，產(chǎn)品中的鋁離子含量遠(yuǎn)低于國際要求水平，安全性更高。
免疫球蛋白
與人血白蛋白類似，球蛋白的生產(chǎn)流程也可分為純低溫乙醇、低溫乙醇+層析和不使用低溫乙醇的全層析工藝。在使用低溫乙醇工藝的生產(chǎn)流程中，免疫球蛋白的制備流程從II沉淀開始，經(jīng)過溶解、深濾、超濾濃縮等步驟取得免疫球蛋白；衛(wèi)光生物的球蛋白制備過程既反映了純低溫乙醇法制備免疫球蛋白的流程。使用低溫乙醇+層析的方法生產(chǎn)免疫球蛋白的，在生產(chǎn)過程中無需制備組分II沉淀，而是使用層析工藝從組分III上清液開始，經(jīng)過深層過濾、脫醇、濃縮、層析、配液等環(huán)節(jié)制程免疫球蛋白。相比之下，擴(kuò)張床和全層析技術(shù)均可不適用低溫乙醇，直接制備得到免疫球蛋白，提升產(chǎn)品純度。
凝血因子
在所有凝血因子類產(chǎn)品中，人纖維蛋白原產(chǎn)品的含量較高，可以使用低溫乙醇法獲得；其余凝血因子類產(chǎn)品在血漿中的含量較少，常溫下化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，難以通過低溫乙醇法分離獲得。因此，除了人纖維蛋白原以外的凝血因子類產(chǎn)品主要采用層析工藝生產(chǎn)，包括親和層析、離子交換層析凝膠層析等工藝。博雅生物的生產(chǎn)工藝即反映了使用凝膠、層析等工藝的人凝血酶原復(fù)合物及凝血因子VIII的生產(chǎn)流程。
微蛋白
在微蛋白中，采用層析技術(shù)制備抗凝血酶、a1-抗胰蛋白酶、a2-巨球蛋白的工藝相對成熟。
圖表 3 - 博雅生物生產(chǎn)工藝流程圖
四、國內(nèi)企業(yè)分離提純工藝發(fā)展?fàn)顩r
國內(nèi)血制品企業(yè)的生產(chǎn)工藝仍然存在較大提升空間。一方面，具備規(guī)模化生產(chǎn)凝血因子類產(chǎn)品（纖維蛋白原除外）的廠商數(shù)量有限；另一方面，大部分廠商仍以低溫乙醇法為主生產(chǎn)白蛋白和球蛋白，僅有部分廠商開始使用低溫乙醇搭配層析法生產(chǎn)靜丙產(chǎn)品。
華蘭生物
華蘭生物4月22日晚間公告稱取得了國家藥監(jiān)局簽發(fā)的三種規(guī)格的靜注人免疫球蛋白《臨床試驗(yàn)通知書》，上述產(chǎn)品是采用層析純化工藝和納米膜過濾+低pH孵放雙重去除病毒工藝制備而成的新一代靜注人免疫球蛋白，在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、產(chǎn)品收率、病毒安全性等方面均得到了提高，目前國內(nèi)尚無同類技術(shù)及高濃度產(chǎn)品上市。
天壇生物
天壇生物于2020年4月公告了控股子公司成都蓉生投資建設(shè)重組凝血八因子車間的公告，總投資4.96億元；結(jié)合其早期公告，成都蓉生的重組因子VIII已經(jīng)進(jìn)入臨床III期研究階段，重組因子VIIa處于臨床前研究階段。為了滿足重組凝血因子類產(chǎn)品后續(xù)的生產(chǎn)需求，成都蓉生擬在永安血制項(xiàng)目基地內(nèi)新建重組凝血因子生產(chǎn)車間及動物房
天壇生物于2019年12月31日公告稱控股子公司成都蓉生藥業(yè)有限責(zé)任公司研制的“靜注人免疫球蛋白（pH4、10%）（層析法）”即將開始臨床III期試驗(yàn)。根據(jù)長江證券的研報(bào)，本次天壇生物申報(bào)的是采用“全層析法”生產(chǎn)的靜丙，回收率超過60%，比低溫乙醇法高10%。除了靜丙外，其余在研的凝血因子VIII、纖維蛋白原、FIX、重組凝血因子等品種的純化工藝均采用了層析技術(shù)。
博雅生物
博雅生物的靜注人免疫球蛋白采用低溫乙醇法結(jié)合層析工藝生產(chǎn)，每噸血漿可生產(chǎn)靜注人免疫球蛋白2600多瓶，位居行業(yè)前列。
上海萊士
上海萊士于2017年12月公告稱司全資子公司同路生物申請變更工藝，將PEG 沉淀法變更為凝膠吸附結(jié)合色譜層析工藝，并已得到國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)簽發(fā)的《藥品補(bǔ)充申請批件》。
衛(wèi)光生物
衛(wèi)光生物在招股書中披露正在聯(lián)合北京大學(xué)開發(fā)結(jié)合層析法與沉淀法等蛋白分離純化技術(shù)，從血漿中分離純化出高純度、高活性的α1-抗胰蛋白酶等多種血漿蛋白。
雙林生物
雙林生物官網(wǎng)顯示，其發(fā)明專利“壓濾工藝分離人血漿蛋白的方法”獲得中國專利優(yōu)秀獎、省專利獎金獎、市專利獎金獎。
五、結(jié)論
根據(jù)公開信息總結(jié)，博雅生物的靜丙生產(chǎn)工藝較為領(lǐng)先，華蘭生物和天壇生物也正在積極研發(fā)，短期內(nèi)對業(yè)績影響有限，但長期看有助于提升公司的綜合競爭力。
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